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噬菌體篩選是一種衣殼蛋白融合的表達(dá)

更新時(shí)間:2021-09-09點(diǎn)擊次數(shù):1078
  噬菌體篩選它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá),融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面,而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系,使得各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。簡(jiǎn)單的淘選程序,是將噬菌體展示肽庫與包被有目的靶分子的平板(或磁珠)共溫育,先洗去未結(jié)合噬菌體,然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增,然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán),以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3-4輪淘選后,通過DNA測(cè)序?qū)γ總€(gè)可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。
  噬菌體篩選展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面,包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬型。生物活性肽分子的鑒定可以通過對(duì)固定在平板上的純化受體進(jìn)行淘選也可以在完整細(xì)胞上進(jìn)行淘選。蛋白酶底物的鑒定可通過在隨機(jī)肽區(qū)域的上游加一段親和tag,然后選用特異性的介質(zhì)來區(qū)分切割和未切割的噬菌體。另外,大的蛋白質(zhì)分子[如:抗體、激素、蛋白酶抑制劑、酶和結(jié)合蛋白也可展示在噬菌體上,通過對(duì)隨機(jī)突變文庫的篩選,分離出各種具有親和力或特異性改變的變異株。
  Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑盒將隨機(jī)十二肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pIII)上,因而是一個(gè)組合文庫。所展示的十二肽表達(dá)在pIII的N末端,即:成熟蛋白的一個(gè)氨基酸就是隨機(jī)十二肽的一個(gè)氨基酸,十二肽后面是一段短小的間隔多肽,由Gly-Gly-Gly-Ser組成,然后是野生型pIII蛋白。該文庫含有~2.7×10個(gè)電轉(zhuǎn)化序列,用10u1本品提供的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)序列一次可產(chǎn)生55個(gè)拷貝,對(duì)原始文庫進(jìn)行大量測(cè)序(見附錄)表明該文庫序列具有廣泛的多樣性,無明顯的殘基位置偏嗜。建議不要擴(kuò)增原始文庫來進(jìn)行另外的淘選試驗(yàn),因?yàn)橐坏┰贁U(kuò)增便會(huì)出現(xiàn)序列偏嗜現(xiàn)象。
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