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選擇合適的抗體,事半功倍

更新時間:2021-09-01點(diǎn)擊次數(shù):1177

子曾經(jīng)曰過“知己知彼,百戰(zhàn)不殆",很多科研工作者對實(shí)驗(yàn)技能出神入化,但對所使用的試劑生產(chǎn)和應(yīng)用知之甚少,導(dǎo)致買到不合適或jiamao偽劣的產(chǎn)品,對時間和經(jīng)費(fèi)造成極大的損失浪費(fèi),所以選擇合適的抗體,事半功倍。


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一.抗體種屬來源的選擇

有人認(rèn)為單抗比多抗好,其實(shí)這并不是一個嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠^點(diǎn),只能說在可能性上單抗的特異性更好一些,而多抗的親和力會優(yōu)于單抗,并且特異性并不一定就遜于單抗,主要看抗原的設(shè)計(jì)水平。目前商品化抗體里單抗主要是鼠單抗、兔單抗,多抗主要是兔多抗、山羊多抗等,其他種屬來源抗體較少。不建議糾結(jié)于單抗好還是多抗好,能做出實(shí)驗(yàn)的抗體就是好抗體。

在選擇上一般建議實(shí)驗(yàn)種屬和抗體種屬親緣性越遠(yuǎn)越好,不宜同源??贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中,需要在區(qū)別于實(shí)驗(yàn)種屬的基礎(chǔ)上,區(qū)分開兩個指標(biāo)的抗體種屬來源,以便于二抗區(qū)別識別。

二.關(guān)于特異性的選擇

特異性的選擇主要需要考慮四個方面:蛋白特異性、種屬特異性、實(shí)驗(yàn)方法特異性、標(biāo)記物的特異性。

(1)蛋白特異性

針對需要檢測的蛋白查找抗體,幾個細(xì)節(jié)要區(qū)分,重組表達(dá)的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測,對抗體的要求是不一樣的,注意查看抗體說明書的檢測說明。如果重組蛋白不是全長表達(dá),則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式,特殊表型的蛋白需要進(jìn)行序列比對,并結(jié)合抗體免疫原序列,查看交叉反應(yīng)的情況。磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點(diǎn),不同位點(diǎn)的磷酸化意味著可能有不同的機(jī)制存在,不宜一概而論。

(2)種屬特異性

同種蛋白不同物種,有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計(jì)多肽抗原的,根據(jù)蛋白的同源性情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。一些稀有種屬很難找到抗體,可以通過蛋白的序列比對,選擇同源序列免疫的抗體,不過一般這種情況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴,如果可以申請到免費(fèi)的抗體樣品,則利于抗體選擇。

(3)實(shí)驗(yàn)方法特異性

目前使用抗體的實(shí)驗(yàn)方法有很多,不同的使用方法過程中,因?yàn)閷Φ鞍讟悠返奶幚矸绞讲灰粯?,蛋白的含量有差異,對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。具體的根據(jù)說明書注明的產(chǎn)品應(yīng)用方法進(jìn)行選擇。但是生產(chǎn)商一般不會將每個抗體都進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的檢測,目前檢測比較多的只是WB、IHC、IF等,如果針對具體的實(shí)驗(yàn)方法沒有找到合適的抗體的,可以結(jié)合蛋白序列分析和抗體的抗原信息,選擇盡可能有效果的抗體。同樣,申請到免費(fèi)的抗體樣品是個很好的途徑。

(4)標(biāo)記物的特異性

一般基于實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)方法不會使用帶有標(biāo)記的一抗,比如WB、IHC等,都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達(dá)到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實(shí)驗(yàn),可能就會使用到直接標(biāo)記的一抗,比如流式實(shí)驗(yàn)。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中,需要選配不同的熒光標(biāo)記物。

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